細胞培養(yǎng)操作規(guī)程，供參考
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1） 準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
二． 細胞處理：
1） 復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。
2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

?

公司細胞現(xiàn)貨供應(yīng)，質(zhì)量有保證、*、實驗效果好，我司為您提供免費代測服務(wù)，同時提供最新價格、說明書、規(guī)格、用途、實驗原理等相關(guān)操作說明。公司產(chǎn)品僅用于科研，不得用于臨床．

注意事項：
1.收到細胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。
2.收到細胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時（視細胞密度而定）穩(wěn)定細胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照（建議收細胞時就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細胞狀態(tài)，100*，200*各一張），觀察記錄細胞在運輸過程中是否有污染情況。作為我方進行銷售依據(jù)。
3.由于細胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊?，故本公司只保證客戶收到細胞后一周內(nèi)的細胞狀態(tài)，故客戶需要售后時需出示收到細胞的時間證明及客戶提供收貨時間和發(fā)現(xiàn)問題后客服人員溝通的時間證明，期間間隔時間不能大于7天。
4.所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。
腺苷酸環(huán)化酶9抗體

細胞培養(yǎng)方法：
1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；
③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；
④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；
⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；
⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。
2、細胞復(fù)蘇：
①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。
②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。
3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；
③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；
④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

CA46(人Butts瘤細胞) 5×106cells/瓶×2 CL-0022AGS(人胃腺癌細胞)5×106cells/瓶×2 小鼠瘤細胞(NK靶細胞);YAC-1DL-MineDL-蛋酸100克BR，99%

家豬皮膚細胞;SSC-S11,3-二亞安基異吲哚啉 97% 1,3-DIIMINOISOINDOLINq 27200-34-

IFNGR1 Others Mouse 小鼠 IFNGR1 / CD119 人細胞裂解液 (陽性對照) 美沙拉嗪 MqsclcMinq 89-27-6

HT-29 人結(jié)腸癌細胞Cyclopentanol羥基500克AR，99%

U-118 MG人腦星形膠質(zhì)母細胞瘤 U-118 MG of brain asocytic blastoma DMEM培養(yǎng)基+10%FBS3325-00-6DL-a-甘油1酸鈉(+4℃)DL-ALPHA-GLYCEROPHOSPHATE DIwo7ium SALT
CL-0037BNL CL.2(小鼠胚胎肝細胞)5×106cells/瓶×2銪標準溶液（1000μg/ml） Europium standard質(zhì)量規(guī)格：1000μg/ml

BI U-87細胞，膀胱癌細胞 總T細胞,OKT3細胞 大鼠嗜堿性粒細胞性白血病細胞;RBL-1氟離子（F-）標準溶液（500mg/L,溶劑：水） Fluoride standard質(zhì)量規(guī)格：500mg/L,溶劑：水

BRL(大鼠肝細胞) 5×106cells/瓶×2氟離子（F-）標準溶液（1000mg/L,基體:水） Fluoride standard質(zhì)量規(guī)格：1000mg/L,基體:水

CPA2 Others Human 人 CPA2 / Carboxypeptidase-A2 人細胞裂解液 (陽性對照) 金標準溶液（1000μg/ml）Gold standard質(zhì)量規(guī)格：1000μg/ml

中國倉鼠卵巢細胞K1(亞系克隆);CHO-K1鍺標準溶液（1000μg/ml）Germanium standard質(zhì)量規(guī)格：1000μg/ml
恒河猴胚腎細胞HK-2, 人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞大麥芽堿(標準品）Hordenine質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥95%，標準品

RN-s, 大鼠紋狀體神經(jīng)元 [X464-20C]細胞 Vero(非洲綠猴腎細胞)丹參素(標準品)Danshensu質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標準品

人十二脂腸腺癌;HuTu-80丹參素Danshensu質(zhì)量規(guī)格：HPLC>95%,丹參提取

CD4 Others Human 人 CD4 / LEU3 人細胞裂解液 (陽性對照) 丹參素鈉(標準品) Danshensu質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%,標準品

人結(jié)直腸腺癌細胞;LoVo丹參酮I（標準品）Tanshinone I質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標準品
細胞接受后的處理：
1） 收到細胞后，請檢查是否漏液，如果漏液，請拍照片發(fā)給我們。若發(fā)現(xiàn)污染或疑似污染，請及時與我們?nèi)〉寐?lián)系。
2） 請先在顯微鏡下確認細胞生長狀態(tài)，去掉封口膜并將T25瓶置于37℃培養(yǎng)約2-3h。
3） 棄去T25瓶中的培養(yǎng)基，添加6ml新的的*培養(yǎng)基。
4） 如果細胞長滿（90%以上）請及時進行細胞傳代。
5） 接到細胞次日，請檢查細胞是否污染，

件而進行實驗觀察，這些因素同樣可以處于嚴格控制之下。
3.研究的樣本可以達到比較均一性
通過細胞培養(yǎng)一定代數(shù)后，所得到的細胞系則可以達到均一性而屬于同一類型的細胞，需要時，可采用克隆化等方法使細胞達到純化。
4.研究內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄
采用各種研究技術(shù)：如倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標記等各種儀器設(shè)備 
記錄方式可采用攝影照片、縮時電影、電視等多種手段。
5.研究的范圍比較廣泛
應(yīng)用的學(xué)科領(lǐng)域較為寬廣，如細胞學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等；
適用的對象范圍廣，從低等動物到高等動物，一種動物的不同年齡階段以及不同組織，都可進行有針對性的研究。
6.研究的費用相對較經(jīng)濟
可提供大量、同一時期、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實驗對象。

?

實驗操作步驟：  公司產(chǎn)品僅用于科研，不得用于臨床．
a．采用認可的方案處死嚙齒動物。    
b．立即在無菌超凈臺內(nèi)用70％乙醇擦洗整個動物。  
c．用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。   
d．用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培養(yǎng)皿上。   
e．剔除胚胎周圍的包膜，將胚胎放于無菌的含有無菌PBS的100ml燒杯中。   
f．漂洗胚胎，去掉PBS。繼續(xù)用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。

實驗材料： 
1. 50ml 配制好的RPMI1640培養(yǎng)液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶 
2. 100ml滅菌燒杯2個； 
3、50ml離心筒2個 
4、滅菌培養(yǎng)皿1個，細胞培養(yǎng)瓶1個 
5、1ml ，200μl移液器各1支；槍頭盒2個；無菌玻璃攪拌棒1個 
6、細胞計數(shù)板1塊； 
7、滅好菌的鑷子1把，剪刀1把； 
8、酒精燈1臺；

?

細胞凍存：
對培養(yǎng)的細胞進行凍存的最佳方法是將細胞置于含有(DMSO)等冷凍保護劑的*培養(yǎng)基中于液氮中儲存。冷凍保護劑可降低培養(yǎng)基的冰點，并可減緩冷卻速度嗎，大大降低冰晶形成的危險  (冰晶可損傷細胞，導(dǎo)致細胞死亡)。
注：DMSO 可促進有機分子進入組織。操作含DMSO的試劑時，應(yīng)采用與此類物質(zhì)安全危害相適應(yīng)的設(shè)備和操作規(guī)范，并應(yīng)按照當?shù)胤ㄒ?guī)處置此類試劑。 
細胞凍存指導(dǎo)原則
凍存細胞系以備將來之用時，必須遵守以下原則。與其他細胞培養(yǎng)操作一樣，我們建議您嚴格遵守您所用細胞系附帶的操作說明，以便獲得最佳結(jié)果。 
1）在高細胞濃度情況下進行培養(yǎng)細胞的凍存，并且細胞傳代次數(shù)盡可能少。確保凍存前活細胞百分比至少為90%。請注意最佳凍存條件取決于所用細胞系。 
2）細胞應(yīng)緩慢冷凍，可使用可控制降溫速度的低溫冰箱或者低溫冷凍容器使溫度每分鐘大約降低1°C。
3）必須使用推薦的凍存培養(yǎng)基。凍存培養(yǎng)基中應(yīng)含有 DMSO 或者甘油等冷凍保護劑
4）將冷凍的細胞于 -70°C 以下溫度儲存；溫度高于 -50°C 時，冷凍的細胞將開始變質(zhì)。 
5）必須使用無菌凍存管儲存冷凍的細胞。裝有冷凍細胞的凍存管可浸于液氮或者在液氮上方的氣相空間內(nèi)保存 
6）必須穿戴個人防護設(shè)備。 
7）所有與細胞接觸的溶液和設(shè)備均應(yīng)為無菌狀態(tài)。必須采用正確的無菌技術(shù)，并且在層流通風(fēng)櫥內(nèi)進行。

實驗操作：
1、培養(yǎng)瓶預(yù)包被。試驗前一天預(yù)包培養(yǎng)瓶，置于超靜臺吹干或45℃烘箱烘干（切記保持無菌），4℃冰箱放置，備用。
2、取材：正常成年大鼠腹腔注射5%麻醉，75%酒精浸泡，無菌條件下迅速取出大鼠主動脈。
3、材料預(yù)處理：將獲取的血管放入含有1% P/S的1 × PBS （pH 7.4 ）中反復(fù)洗滌，去除血管外部的洗滌液澄清，用無菌鑷子剝?nèi)ネ饽っ娴臍埩艚M織。PBS洗滌凈。
4、除去內(nèi)皮細胞：將血管縱向剪開， 內(nèi)膜面向上，無菌鑷子沿中軸方向反復(fù)刮動內(nèi)膜層4-5遍，去掉內(nèi)皮細胞，用1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次。
5、分離中膜：將去掉內(nèi)膜的血管，繼續(xù)刮動分離中膜，去掉外膜，用眼科剪將內(nèi)膜剪碎為1×1mm3的小塊，加入1 × PBS （pH 7.4 ），轉(zhuǎn)移到15ml 離心管中，PBS洗滌3次，離心收集沉淀物。
6、消化：在洗凈的內(nèi)膜碎塊中加入消化酶液，將離心管放入37℃水浴消化15min。
7、終止消化：吸出消化液入新的離心管中，按1：1加入消化終止液，中止酶反應(yīng)；余下的組織繼續(xù)加入消化液，消化15min ，重復(fù)消化3次。
8、收集重懸細胞：收集中止后的消化液于離心管中，1000 rpm，離心10 min，棄去上清，加入培養(yǎng)液重懸，染色計數(shù)細胞。
9、培養(yǎng)細胞密度：調(diào)整細胞密度以5 × 105個/ml 接種入培養(yǎng)瓶。
10、培養(yǎng)：放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。

NCI-H2170(人肺鱗癌細胞) 5×106cells/瓶×2Gly-lleu甘酰-L-異亮酸1克BR，98%

BRL(大鼠肝細胞) 5×106cells/瓶×2 CM-M054小鼠成纖維細胞*培養(yǎng)基100mL 人結(jié)直腸腺癌細胞;Caco-23,4-二安基本加醋;3,4-二安基安息香醋 3,4-DicMinobqnzoic ccid 619-02-6

恒河猴皮膚細胞;RM-S1Fmoc-D-Cys(Trt)-OHN-Fmoc-N'-三本甲基- D-半胱酸25克特，98%

NCF2 Others Human 人 NCF2 / NCF-2 / P67phox 桿狀病毒-昆蟲細胞裂解液 (陽性對照) 快速1試驗瓊脂shēng huà shì jì容量：2～8℃100毫升

胰腺星狀細胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)胞苷-5’-二1酸鈉鹽NA
CD63 Others Cynomolgus 食蟹猴 CD63 / Tspan-30 / Teaspanin-30 人細胞裂解液 (陽性對照) 異甘草素（標準品）Isoliquiritigenin質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標準品

結(jié)腸粘膜上皮細胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)人參皂苷Re(標準品)Ginsenoside Re質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標準品

MEF-7/Adr細胞，腺癌阿霉素耐藥株 人卵巢癌細胞,HOC1細胞 人成纖維細胞裂解物HMFL人參皂苷F4,人參皂苷Rg4Ginsenoside F4質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標準品

恒河猴腎細胞;LLC-MK2人參皂苷RK3(標準品)Ginsenoside RK3質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%,標準品

ICAM3 Others Human 人 CD50 / ICAM3 人細胞裂解液 (陽性對照) 人參皂苷RH4Ginsenoside RH4質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標準品
大鼠胰腺外分泌細胞B3G2 Others Human 人 B3G2 人細胞裂解液 (陽性對照) 朝藿定A(標準品）Epimedin A質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標準品

人髂動脈內(nèi)皮細胞*培養(yǎng)基 100mL朝藿定A1(標準品)Epimedin A1質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標準品

L929細胞，小鼠成纖維細胞 3T3-L1(小鼠脂肪細胞) 小鼠腦瘤細胞;BC3H1朝藿定B（標準品）Epimedin B質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標準品

CSF1 Protein Human 重組人 / 食蟹猴 M-CSF / CSF-1 蛋白 (His 標簽)朝藿定C（標準品）Epmedin C質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標準品

TF-1(人血液白血病細胞) 5×106cells/瓶×2 小鼠腦瘤細胞;BC3H1橙黃決明素(標準品)Aurantio-obtusin質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標準品
冷凍保存細胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。